Bonińska Małgorzata

Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej
Pracownia Teoretycznych Podstaw Chemii Analitycznej

Przygotowanie i oznaczanie białka wzorcowego znakowanego selenometioniną dla metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej 9 (MMP-9)

Małgorzata Bonińska

Kierownik: Prof. dr hab. Ewa Bulska
Opiekun: Dr Anna Konopka

Celem pracy była synteza, charakteryzacja cząsteczkowa i oznaczenie rekombinowanego białka wzorcowego dla metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej 9, MMP-9. Białko wzorcowe zsyntezowano in vitro w ekstrakcie E. coli wykorzystując do znakowania selenometioninę (SeMet) oraz aminokwasy (argininę i lizynę) znakowane trwałymi izotopami azotu i węgla (¹⁵N i ¹³C). Przeprowadzono syntezę dwóch białek wzorcowych: białka znakowanego wyłącznie selenometioniną oraz białka znakowanego selenometioniną oraz izotopami ¹⁵N i ¹³C . Do oczyszczenia białek wzorcowych wykorzystano technikę dializy. Następnie przeprowadzono trawienie białek wzorcowych za pomocą trypsyny w żelu poliakrylamidowym. Otrzymaną mieszaninę peptydów analizowano wykorzystując technikę chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (nanoUHPLC-ESI(Orbitrap)-MS/MS). Analiza ta potwierdziła poprawność syntezy obu białek wzorcowych dla MMP 9 pod kątem ich sekwencji aminokwasowej oraz obecności pożądanych znaczników w postaci SeMet oraz trwałych izotopów ¹⁵N i ¹³C. Do oznaczenia białek wzorcowych wykorzystano technikę spektrometrii mas z jonizacją w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-MS). Porównano trzy procedury przygotowania próbki białka do analizy ilościowej: a) poprzez nastrzyk próbki bez wcześniejszej mineralizacji, b) poprzez nastrzyk próbki po mineralizacji prowadzonej pod ciśnieniem atmosferycznym oraz c) poprzez nastrzyk próbki po mineralizacji prowadzonej pod podwyższonym ciśnieniem. Oznaczenia białek dokonano na podstawie detekcji ⁷⁸Se oraz ⁸²Se stosując metodę krzywej kalibracyjnej. Analiza ilościowa wykazała straty białek występujące podczas mineralizacji próbek.