Bicka Marta
Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej
Pracownia Teoretycznych Podstaw Chemii Analitycznej
Przygotowanie białka wzorcowego i jego zastosowanie do oznaczenia białka MMP-9 metodą nano-UHPLC-ESI-(Orbitrap)MS/MS w próbkach osocza krwi myszy
Marta Bicka
Kierownik: Prof. Dr hab. Ewa Bulska, dr Anna Konopka
Opiekun: mgr Andrzej Gawor
Obecnie techniki spektrometrii mas połączone z technikami wysokosprawnej chromatografii cieczowej są szeroko stosowane zarówno w analizie jakościowej jak i ilościowej białek. W celu uzyskania informacji ilościowej niezbędne jest zastosowanie substancji wzorcowych. W przypadku analizy białek należy stosować ich wzorce wewnętrzne, o pełnej sekwencji aminokwasowej znakowane trwałymi izotopami.
Celem prezentowanej pracy magisterskiej było stworzenie oraz oznaczenie rekombinowanego białka wzorcowego dla metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej 9, MMP-9, znakowanego izotopami 13C i 15N, które następnie wykorzystano jako wzorzec wewnętrzny do oznaczenia endogennego białka MMP-9 w osoczu krwi myszy metodą nano-UHPL-ESI-(ORBITRAP)MS/MS. Do syntezy białka wzorcowego wykorzystano procedurę analityczną o nazwie RSQ&RIQ (ang. Recombinant Selenium Quantified & Recombinant Isotope-labelled and Quantified) [1], która pozwoliła na uzyskanie dwóch rekombinowanych białek wzorcowych RSQ oraz RIQ. Białka RSQ i RIQ otrzymano dzięki zastosowaniu syntezy in vitro w ekstraktach E.coli, która umożliwia wprowadzenia znakowanych aminokwasów do sekwencji tylko jednego wybranego białka. Białko wzorcowe RSQ-MMP-9 zawierające selen w postaci selenometioniny, zostało dokładnie oznaczone za pomocą techniki ICP-MS poprzez detekcję 78Se i 82Se. Następnie białko RSQ-MMP-9 wykorzystano jako wzorzec wewnętrzny do oznaczenia białka RIQ-MMP-9, znakowanego izotopami 13C i 15N w postaci 13C615N4-Arg i 13C615N2-Lys, przy użyciu metody nano-UHPLC-ESI-(ORBITRAP)MS/MS. Pod koniec prowadzonego eksperymentu scharakteryzowane i oznaczone białko wzorcowe RIQ-MMP-9 zastosowano jako wzorzec wewnętrzny do oznaczeń białka endogennego MMP-9 w próbkach osocza krwi myszy.
Literatura:
[1] Konopka A., Zinn N., Lehmann W.D. Preparation of heteroelement-incorporated and stable isotope-labeled protein standards for quantitative proteomics. Methods Mol Biol 2014, 1156, 337-363