Shur Kucman
Zakład Dydaktyczny Chemii Nieorganicznej i Analitycznej
Pracownia Teorii i Zastosowań Elektrod
Próba ekspresji i rekonstytucji w fazach kubicznych mitochondrialnego kanału potasowego
Shur Kucman
Promotor: prof. dr hab. Renata Bilewicz
Współpromotor i opiekun: dr Bogusz Kulawiak (IBD PAN, Zakład Biochemii, Pracownia Wewnątrzkomórkowych Kanałów Jonowych)
Niedotlenienie komórek serca i mózgu jest jedną z głównych przyczyn zgonów we współczesnym świecie. W wewnętrznej błonie mitochondrialnej zidentyfikowano grupę kanałów potasowych, których aktywacja może prowadzić do zjawiska cytoprotekcji tzn. osłony komórek/tkanek przed uszkodzeniem indukowanym niedotlenieniem. Istotną rolę w tym procesie odgrywa kanał mitoBKCa – kanał potasowy o dużym przewodnictwie aktywowany jonami wapnia. Kanały typu BKCa zbudowane są z podjednostek alfa, tworzących por kanału oraz podjednostek regulatorowych beta. Pomimo intensywnych badań mechanizm cytoprotekcji nie jest do końca poznany. Opisanie regulacji aktywności kanału wydaje się kluczowe dla zrozumienia obserwowanych zjawisk.
Prezentowany projekt ma charakter multidyscyplinarny, a jego głównym celem jest ekspresja, a następnie próba rekonstytucji izolowanych, funkcjonalnych kanałów mitoBKCa w ciekłokrystalicznych matrycach lipidowych – fazach kubicznych.
W pierwszej części projektu, wykorzystując metody biologii molekularnej, przygotowano plazmidy kodujące wybrane podjednostki ludzkiego kanału mitoBKCa. Podjednostki wklonowano do wektora pBABE (Adgene) umożliwiającego odpowiednio niską ekspresję badanych białek. Obecność DNA kodującego wybrane podjednostki potwierdzono poprzez analizę produktów reakcji PCR amplifikujących wklonowane sekwencje (analiza na żelu agarozowym oraz sekwencjonowanie DNA).
Następnie, w oparciu o dziką, ssaczą linię komórkową astrocytomy (U87-MG) wyprowadzono linię zawierającą mutacje w genie kodującym podjednostkę alfa, skutkujące brakiem ekspresji tego białka. W tym celu wykorzystano technikę CRISPR/Cas9. Linię wyselekcjonowano wykorzystując technikę Western Blot oraz przeciwciała rozpoznające podjednostkę alfa. Obecność mutacji potwierdzono z wykorzystaniem sekwencjonowania DNA izolowanego z uzyskanych linii. Linia ta posłuży jako platforma do trwałej ekspresji podjednostek kanału mitoBKCa, kodowanych na otrzymanych plazmidach.
Równolegle podjęto próbę przejściowej ekspresji badanych podjednostek w celu potwierdzenia ich obecności w mitochondriach wybranych linii komórkowych.
Z komórek trwale ekspresjonujących podjednostki kanału wyizolowane będą funkcjonalne kanały mitoBKCa, które poddane zostaną rekonstytucji do faz kubicznych. Wykorzystanie tej techniki pozwoli na analizę prądów płynących przez dużą populację kanałów. Skuteczne zastosowanie tego podejścia metodologicznego może pozwolić na lepsze zrozumienie regulacji tego kanału. Wiedza ta przybliży nas do lepszego zrozumienia mechanizmów cytoprotekcyjnych indukowanych przez mitochondrialne kanały potasowe.