Milczarek Weronika
Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej
Pracownia Teorii i Zastosowań Elektrod
Oznaczanie lizozymu przy użyciu unieruchomionej na elektrodzie warstwy mieszanej: aptamer i klastery złota
Weronika Milczarek
Promotor: dr hab. Agnieszka Więckowska, prof. ucz.
Opiekun: mgr Marcin Jaskółowski
Lizozym (muramidaza) to białko kationowe, które występuję u zwierząt, roślin czy bakterii oraz wirusów. Enzym ten działa bakteriobójczo wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych poprzez katalizowanie hydrolizy wiązania β-1,4-glikozydowego [1]. Lizozym z białka jaja kurzego jest modelowym enzymem do badań dotyczących jego funkcji oraz struktury. To właśnie w białku jaja kurzego jest on dominującym alergenem o nazwie Gal d4, który nawet w niewielkich ilościach może powodować reakcję alergiczne. W związku z tym ważne jest wykrywanie go w produktach spożywczych w szczególności przeznaczonych dla osób z alergią. Na rynku dostępne są kosztowne testy immunoenzymatyczne ELISA wykorzystujące przeciwciała do ilościowej oceny zawartości lizozymu w produktach spożywczych. Dlatego w ostatnich latach obserwowany jest wzrost zastosowania biosensorów opartych o inną zasadę działania do oznaczania lizozymu. Jednym z przykładów tworzenia innych warstw receptorowych jest wykorzystanie aptamerów, które pełnią rolę cząsteczek biorozpoznawczych. Zalety takiego rozwiązania to niski koszt produkcji, czy odporność na denaturację i degradację [2,3].
Celem pracy było skonstruowanie warstwy czułej na lizozym z białka kurzego poprzez odpowiednią modyfikację powierzchni elektrody cząsteczkami tiolowanego aptameru LBA (ang. lysozyme binding aptamer). Tworzenie takiej warstwy było wspomagane obecnością odpowiednich tioli wypełniających, a następnie zbadano wpływ obecności klasterów złota w warstwie. Otrzymane warstwy aptemerowe jak i warstwy mieszane zawierające zarówno aptamer jak i klastery złota poddano analizie technikami elektrochemicznymi, spektroskopii rezonansu plazmowego (SPR) i mikroskopii sił atomowych (AFM) w celu zbadania ich właściwości.
Techniki elektrochemiczne pozwoliły na charakterystykę warstw na powierzchni złota oraz wyznaczenie gęstości zaadsorbowanych nici DNA i zbadanie odpowiedzi bioczujnika na obecność lizozymu. Natomiast technika spektroskopii rezonansu plazmonów powierzchniowych umożliwia oszacowanie grubości otrzymanej warstwy na powierzchni złota i obserwację zjawiska wiązania lizozymu do aptameru w czasie rzeczywistym. Pomiary metodą mikroskopii sił atomowych umożliwiają wizualizację warstw na powierzchni złotej bez i z dodatkiem klasterów złota.
Literatura:
[1] Melinte G., Selvoni G., Cristea C., Mrrazaa G., Aptasensor for lysozyme detection: Recent advances; Talanta 2021, 226, 122169.
[2] Vasilescu A., Wang Q., Li M., Boukherroub R., Szunertis S., Aptamer-Based Electrochemical Sensing of Lysozyme; Chemosensors, 2016, 4,10.
[3] Tran DT., Janssen KP., Pollet J., Lammertyn E., Anné J., Van Schepdael., Lammertyn J., Selection and characterization of DNA aptamers for egg white lysozyme; Molecules, 2010, 15, 1127.